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a la fusión de gametos, lo que convierte a SPACA6 e IZUMO1 en miembros fundadores de una superfamilia de proteínas asociadas a la fertilización, denominada aquí superfamilia IST.La superfamilia IST se define estructuralmente por su haz distorsionado de cuatro hélices y un par de motivos CXXC unidos por disulfuro.Una búsqueda basada en la estructura del proteoma humano AlphaFold identificó más miembros proteicos de esta superfamilia;Sorprendentemente, muchas de estas proteínas están vinculadas a la fusión de gametos.La estructura SPACA6 y su conexión con otros miembros de la superfamilia IST proporcionan un eslabón perdido en nuestro conocimiento de la fusión de gametos de mamíferos.Cada vida humana comienza con dos gametos haploides separados: un espermatozoide del padre y un ovocito de la madre.Este espermatozoide fue el ganador de un proceso intensivo de selección en el que millones de espermatozoides atravesaron el tracto reproductivo femenino, atravesaron diversas barreras1 y se sometieron a procesos de capacitación que aumentaron su motilidad y composición superficial2,3,4.Incluso una vez que el espermatozoide y el ovocito se han encontrado, el proceso no ha terminado.Los ovocitos están rodeados por una capa de células del cúmulo, así como por una barrera de glucoproteínas denominada zona pelúcida, por las cuales deben pasar los espermatozoides para acceder al ovocito.Los espermatozoides utilizan una combinación de moléculas de adhesión a la superficie y enzimas secretadas y asociadas a la membrana para atravesar estas barreras finales5.Estas moléculas y enzimas se almacenan predominantemente dentro de la membrana interna y la matriz del acrosoma y se revelan a través de la disolución de la membrana externa de los espermatozoides durante la reacción del acrosoma6.El paso final de este intenso viaje es el evento de fusión espermatozoide-óvulo, donde las dos células fusionan sus membranas celulares y se convierten en un solo organismo diploide7.A pesar de que este proceso es fundamental en la reproducción humana, se sabe poco sobre las interacciones moleculares requeridas.Fuera de la fertilización de gametos, el proceso químico de fusión de dos bicapas lipídicas se ha estudiado ampliamente.En general, la fusión de membranas es un proceso energéticamente desfavorable, que requiere catalizadores de proteínas que experimentan cambios en la conformación estructural para acercar dos membranas, interrumpir su continuidad e inducir la fusión8,9.Apodados fusógenos, estos catalizadores de proteínas se han encontrado en una miríada de sistemas de fusión.Son necesarios para la entrada del virus en las células huésped (p. ej., gp160 en el VIH-1, pico en los coronavirus, hemaglutinina en los virus de la influenza)10,11,12, la formación de la placenta (sincitinas)13,14,15 y en los gametos. fusión de eucariotas inferiores (HAP2/GCS1 en plantas, protistas y artrópodos)16,17,18,19.Aún no se ha descubierto el fusógeno para los gametos humanos, aunque se ha demostrado que varias proteínas son vitales para la unión y fusión de los gametos20.El primero descubierto fue el CD9 expresado en ovocitos, una proteína transmembrana necesaria para la fusión de gametos tanto en ratones como en humanos21,22,23.Aunque su función exacta sigue sin estar clara, es probable que participe en la adhesión, la estructuración de los puntos focales adhesivos en las microvellosidades del huevo y/o la localización adecuada de las proteínas de la superficie del ovocito24,25,26.Las dos proteínas críticas mejor caracterizadas para la fusión de gametos son la proteína espermática IZUMO127 y la proteína ovocitaria JUNO28, que se unen entre sí como un paso esencial en el reconocimiento de gametos y la adhesión previa a la fusión.Los ratones machos knockout para Izumo1 y hembras knockout para Juno son completamente infértiles;en estos modelos, los espermatozoides penetran el espacio perivitelino, pero los gametos no logran fusionarse27,28.Asimismo, en experimentos de fecundación in vitro humana, se produce una reducción de la fusión cuando los gametos son tratados con anticuerpos contra IZUMO1 o JUNO27,29.Recientemente, se ha descubierto una colección de proteínas expresadas en espermatozoides recién descubiertas con fenotipos similares a IZUMO1 y JUNO20,30,31,32,33,34,35.La proteína 6 asociada a la membrana del acrosoma espermático (SPACA6) se identificó como esencial en la fertilización durante un estudio de mutagénesis a gran escala en ratones.La inserción del transgén en el gen Spaca6 produjo espermatozoides incapaces de fusionarse, aunque estos espermatozoides penetraron en el espacio perivitelino36.Estudios posteriores de inactivación en ratones confirmaron que Spaca6 es esencial para la fusión de gametos30,32.SPACA6 se expresa casi exclusivamente en los testículos y tiene un patrón de localización similar al de IZUMO1, es decir, dentro de la membrana interna de los espermatozoides antes de la reacción del acrosoma, seguido de reubicación en la región ecuatorial después de la reacción del acrosoma30,32.Los homólogos de Spaca6 se encuentran en una variedad de mamíferos y otros eucariotas30, y su importancia para la fusión de gametos humanos se ha establecido a través de la inhibición anti-SPACA6 de la fertilización in vitro humana30.A diferencia de IZUMO1 y JUNO, los detalles sobre la estructura, las interacciones y la función de SPACA6 siguen sin estar claros.Con el interés de comprender mejor los procesos fundamentales detrás de la fusión de espermatozoides y óvulos humanos, informando así los avances futuros tanto en la planificación familiar como en el tratamiento de la infertilidad, llevamos a cabo estudios estructurales y bioquímicos de SPACA6.La estructura cristalina del ectodominio SPACA6 reveló un haz de cuatro hélices (4HB) y un dominio similar a inmunoglobulina (similar a Ig) que están conectados por una región casi flexible.Como se predijo en estudios previos7,32,37, la arquitectura de dominio de SPACA6 es similar a la de IZUMO1 humano, con ambas proteínas compartiendo un motivo poco común: un 4HB con una cara triangular de hélices y un par de motivos CXXC unidos por disulfuro.Proponemos que IZUMO1 y SPACA6 ahora definan una superfamilia más grande y estructuralmente relacionada de proteínas asociadas a la fusión de gametos.Usando las características distintivas específicas de la superfamilia, llevamos a cabo una búsqueda exhaustiva del proteoma humano estructural AlphaFold, revelando miembros adicionales de esta superfamilia, incluidos varios relacionados con la fusión de gametos y/o la fertilización.Ahora parece que hay un pliegue estructural común y una superfamilia de proteínas que están asociadas con la fusión de gametos, y nuestra estructura proporciona una imagen molecular de este importante aspecto de la maquinaria de fusión de gametos humanos.SPACA6 es una proteína transmembrana de un solo paso con un glucano unido a N y seis enlaces disulfuro predichos (Figs. S1a y S2).Expresamos el dominio extracelular de SPACA6 humano (residuos 27–246) en células Drosophila S2 y purificamos la proteína mediante cromatografías de afinidad por níquel, intercambio catiónico y exclusión por tamaño (Fig. S1b).El ectodominio SPACA6 purificado era altamente estable y homogéneo.El análisis con cromatografía de exclusión por tamaño acoplada a dispersión de luz multiángulo (SEC-MALS) reveló un pico único con un peso molecular calculado de 26,2 ± 0,5 kDa (Fig. S1c).Esto es consistente con el tamaño de un ectodominio SPACA6 monomérico, lo que indica que no se produjo oligomerización durante la purificación.Además, la espectroscopia de dicroísmo circular (CD) reveló una estructura mixta α / β con una temperatura de fusión de 51, 3 ° C (Fig. S1d, e).La desconvolución de los espectros de CD mostró 38, 6% de hélice α y 15, 8% de elementos de cadena β (Fig. S1d).El ectodominio SPACA6 se cristalizó utilizando un enfoque de microsiembra de matriz aleatoria38, lo que produjo un conjunto de datos de resolución de 2,2 Å (Tabla 1 y Fig. S3).La estructura se determinó utilizando una combinación de reemplazo molecular basado en fragmentos y datos de fase SAD de remojos de bromuro (Tabla 1 y Fig. S4), con el modelo refinado final que consta de los residuos 27–246.En el momento de la determinación de la estructura, no había estructuras experimentales o AlphaFold disponibles.El ectodominio SPACA6, con dimensiones de 20 Å × 20 Å × 85 Å, está formado por siete hélices y nueve hebras β y adopta un pliegue terciario alargado estabilizado por seis enlaces disulfuro (Fig. 1a, b).La densidad de electrones débil al final de la cadena lateral de Asn243 sugiere que este residuo está glicosilado con enlace N.La estructura consta de dos dominios: un paquete de cuatro hélices N-terminal (4HB) y un dominio similar a Ig C-terminal, con una región de bisagra intermedia entre los dos (Fig. 1c).a Estructura del ectodominio SPACA6.Diagrama de cinta del ectodominio SPACA6, con la cadena de los extremos N a C coloreados de azul oscuro a rojo oscuro.Las cisteínas involucradas en los enlaces disulfuro son de color magenta.b Diagrama de topología del ectodominio SPACA6.Se utiliza el mismo esquema de color que en la Fig. 1a.c Dominios del ectodominio SPACA6.Diagrama de cinta con los dominios 4HB, bisagra e Ig de color naranja, verde y azul, respectivamente.La capa de membrana no está dibujada a escala.El dominio 4HB de SPACA6 incluye cuatro hélices principales (Hélices 1–4) dispuestas en espiral (Fig. 2a) que alternan entre interacciones antiparalelas y paralelas (Fig. 2b).Una pequeña hélice adicional de una sola vuelta (Hélice 1′) se empaqueta perpendicularmente con el paquete, formando una forma triangular con las Hélices 1 y 2. Este triángulo produce una ligera distorsión en el empaque de la bobina enrollada en relación con el empaque apretado de las Hélices 3 y 4 (Figura 2a).un diagrama de cinta del N-terminal 4HB.b Vista de arriba hacia abajo del haz de cuatro hélices, con cada hélice de color azul oscuro en el extremo N y rojo oscuro en el extremo C.c Diagrama de rueda helicoidal de arriba hacia abajo del 4HB con cada residuo presentado como un círculo marcado con el código de aminoácido de una letra;solo se numeran los cuatro aminoácidos que se encuentran en la parte superior de la rueda.Los residuos no polares son de color amarillo, los residuos polares sin carga son verdes, los residuos con carga positiva son azules y los residuos con carga negativa son rojos.d Cara triangular del dominio 4HB con el 4HB de color naranja y la bisagra de color verde.Los dos recuadros muestran los enlaces disulfuro como barras.El 4HB se centra alrededor de un núcleo hidrofóbico interno formado predominantemente por residuos alifáticos y aromáticos (Fig. 2c).El núcleo alberga un enlace disulfuro entre Cys41 y Cys55, que une las hélices 1 y 2 en la parte superior, acentuando la forma triangular (Fig. 2d).Se forman dos enlaces disulfuro adicionales entre el motivo CXXC de Helix 1' y otro motivo CXXC que se encuentra en la punta de una horquilla β en la región bisagra (Fig. 2d).Un residuo de arginina conservado (Arg37) de función desconocida reside dentro del hueco triangular producido por las hélices 1', 1 y 2. Los carbonos alifáticos Cβ, Cγ y Cδ de Arg37 interactúan con el núcleo hidrofóbico y su grupo guanidio hace contacto con el bucle entre las hélices 1 'y 1 a través de las interacciones de la cadena principal y lateral de Thr32 (Fig. S5a, b).Tyr34 se extiende sobre el hueco, dejando dos pequeñas cavidades a través de las cuales Arg37 puede interactuar con el solvente.Los dominios tipo sándwich β tipo Ig son una gran superfamilia de proteínas que comparten la característica común de dos o más láminas β anfipáticas multicatenarias que interactúan a través de un núcleo hidrofóbico39.El dominio similar a Ig C-terminal de SPACA6 sigue este mismo patrón;consta de dos hojas (Fig. S6a).La hoja 1 es una hoja β de cuatro cadenas (cadenas D, F, H e I) en la que las cadenas F, H e I forman un arreglo antiparalelo, y las cadenas I y D adoptan una interacción paralela.La hoja 2 es una pequeña hoja β antiparalela de dos cadenas (cadenas E y G).Se observa un enlace disulfuro interno entre el extremo C-terminal de Strand E y el centro de Strand H (Cys170-Cys226) (Fig. S6b).Este enlace disulfuro es similar al de los dominios sándwich β de las proteínas de inmunoglobulina40,41.La hoja β de cuatro hebras se retuerce sustancialmente en toda su longitud, produciendo bordes asimétricos que son distintos en forma y electrostática.El borde más delgado presenta una superficie hidrofóbica plana al medio ambiente, que se destaca contra el resto de la superficie desigual y electrostáticamente diversa en SPACA6 (Fig. S6b, c).Un halo de grupos carbonilo/amino de la columna vertebral expuestos y cadenas laterales polares rodea la superficie hidrofóbica (Fig. S6c).El borde más ancho está parcialmente cubierto por un segmento enrollado que bloquea la porción N-terminal del núcleo hidrofóbico y forma tres enlaces de hidrógeno con los grupos polares de la columna vertebral expuestos de Strand F (Fig. S6d).La porción C-terminal de este borde produce una bolsa grande con un núcleo hidrofóbico parcialmente expuesto.El bolsillo está rodeado de cargas positivas debido a tres conjuntos de residuos de arginina duales (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 y Arg212-Arg214) y una histidina central (His220) (Fig. S6e).La región bisagra es un segmento corto entre los dominios helicoidales y similares a Ig que se compone de una única hoja β antiparalela de tres cadenas (Cadenas A, B y C), una pequeña hélice 310 y varios segmentos largos de espiral aleatorios. (Figura S7).Una red de contactos covalentes y electrostáticos en la región bisagra parece estabilizar la orientación entre los dominios 4HB y tipo Ig.Esta red se puede dividir en tres secciones.La primera sección incluye los dos motivos CXXC (27CXXC30 y 139CXXC142) que forman un par de enlaces disulfuro entre una horquilla β en la bisagra y la hélice 1' en el 4HB.La segunda sección implica una interacción electrostática entre el dominio similar a Ig y la bisagra.Glu132 en la bisagra forma puentes salinos con Arg233 en el dominio similar a Ig y Arg135 en la bisagra.La tercera sección implica un enlace covalente entre el dominio similar a Ig y la región bisagra.Dos enlaces disulfuro (Cys124-Cys147 y Cys128-Cys153) conectan un bucle en la región bisagra, que se estabiliza mediante interacciones electrostáticas entre Gln131 y los grupos funcionales de la cadena principal, a un enlazador que conduce a la primera hebra del dominio similar a Ig.La estructura del ectodominio SPACA6 y las estructuras separadas de los dominios 4HB y similar a Ig se usaron para buscar entradas estructuralmente similares en el banco de datos de proteínas42.Identificamos coincidencias con puntajes Z de Dali altos, desviaciones cuadráticas medias pequeñas y puntajes LALI grandes (este último indica el número de residuos estructuralmente equivalentes).Si bien los 10 resultados principales de la búsqueda completa del ectodominio (Tabla S1) tienen puntajes Z razonables de> 842, las búsquedas de solo los dominios 4HB o similares a Ig revelaron que la mayoría de estos resultados se alinean solo con el sándwich β, un pliegue ubicuo en muchas proteínas.Solo un resultado estuvo presente en las tres búsquedas de Dali: IZUMO1.Durante mucho tiempo se ha sospechado que SPACA6 e IZUMO1 comparten similitudes estructurales7,32,37.A pesar de que los ectodominios de las dos proteínas asociadas a la fusión de gametos comparten una identidad de secuencia de solo el 21% (Fig. S8a), la evidencia compuesta que incluye un patrón de enlace disulfuro conservado y un dominio similar a Ig C-terminal previsto en SPACA6 permitió un intento temprano de un modelo de homología de ratón SPACA6, utilizando IZUMO1 como plantilla37.Nuestra estructura confirma estas predicciones y revela el verdadero alcance de la similitud.De hecho, la estructura de SPACA6 e IZUMO137,43,44 comparten la misma arquitectura de dos dominios (Fig. S8b) con dominios tipo sándwich β similares a 4HB e Ig conectados por una región bisagra (Fig. S8c).IZUMO1 y SPACA6 4HBs comparten desviaciones de los paquetes helicoidales tradicionales.El 4HB canónico, como los que se encuentran en los complejos proteicos SNARE involucrados en la fusión endosómica45,46, tiene hélices uniformemente distanciadas que mantienen una curvatura constante alrededor de un eje central47.Por el contrario, los dominios de bobina enrollada tanto en IZUMO1 como en SPACA6 están distorsionados con curvaturas inconsistentes y empaquetamiento desigual (Fig. S8d).La distorsión probablemente se deba a la forma triangular formada por las hélices 1', 1 y 2, conservada en IZUMO1 y SPACA6 y estabilizada por el mismo motivo CXXC en la hélice 1'.Sin embargo, un disulfuro adicional que se encuentra en SPACA6 (los mencionados Cys41 y Cys55 que unen covalentemente las hélices 1 y 2) produce un vértice mucho más nítido en la parte superior del triángulo, lo que hace que SPACA6 esté aún más distorsionado que IZUMO1 con una cavidad más pronunciada en el centro de el triangulo.Además, IZUMO1 carece del Arg37 observado en el centro de esta cavidad en SPACA6.En cambio, IZUMO1 tiene un núcleo hidrofóbico más típico de residuos alifáticos y aromáticos.IZUMO1 tiene un dominio similar a Ig compuesto por una hoja β de dos cadenas y una de cinco cadenas43.La hebra adicional en IZUMO1 reemplaza la bobina en SPACA6 que interactúa con la hebra F para tapar los enlaces de hidrógeno de la columna vertebral en la hebra.Un punto interesante de comparación está en las cargas superficiales predichas para los dominios similares a Ig de estas dos proteínas.La superficie de IZUMO1 tiene una carga más negativa que la de SPACA6.Las cargas adicionales se encuentran cerca del extremo C-terminal, que mira hacia la membrana del espermatozoide.En SPACA6, las mismas áreas son más neutras o cargadas positivamente (Fig. S8e).Por ejemplo, tanto la superficie hidrofóbica (borde más delgado) como el hoyo cargado positivamente (borde más ancho) en SPACA6 están cargados negativamente en IZUMO1.Mientras que las conectividades y los elementos de la estructura secundaria están bien conservados entre IZUMO1 y SPACA6, una alineación estructural de los dominios similares a Ig reveló que las orientaciones generales de los dos dominios entre sí son diferentes (Fig. S9).El haz helicoidal de IZUMO1 se dobla en relación con el emparedado β, produciendo una forma de "boomerang" descrita anteriormente que se desvía unos 50° del eje central43.En contraste, el haz helicoidal en SPACA6 tiene una inclinación de aproximadamente 10° en la dirección opuesta.Estas diferencias en la orientación probablemente se deban a diferencias dentro de la región bisagra.A nivel de secuencia primaria, IZUMO1 y SPACA6 casi no comparten similitud de secuencia en la bisagra, excepto por los residuos de cisteína, una glicina y un aspartato.Como resultado, las redes electrostáticas y de enlaces de hidrógeno son completamente diferentes.El elemento de estructura secundaria de la hoja β se comparte entre IZUMO1 y SPACA6, aunque las hebras son mucho más largas en IZUMO1, y la hélice 310 (Hélice 5) es exclusiva de SPACA6.Estas discrepancias dan como resultado diferentes orientaciones de dominio de las dos proteínas por lo demás similares.Nuestra búsqueda en el servidor Dali reveló que SPACA6 e IZUMO1 son las únicas dos estructuras determinadas experimentalmente depositadas en el Banco de datos de proteínas que comparten este pliegue 4HB particular (Tabla S1).Recientemente, DeepMind (Alphabet/Google) desarrolló AlphaFold, un sistema basado en redes neuronales que predice con precisión la estructura 3D de proteínas a partir de una secuencia primaria48.Poco después de que resolviéramos la estructura SPACA6, se lanzó la base de datos AlphaFold, que proporciona modelos estructurales predichos que cubren el 98,5 % de todas las proteínas en el proteoma humano48,49.Usando nuestra estructura resuelta de SPACA6 como modelo de búsqueda, la búsqueda de homología estructural de los modelos en el proteoma humano AlphaFold identificó candidatos con estructuras potencialmente similares a las de SPACA6 e IZUMO1.Dada la increíble precisión de AlphaFold en la predicción de SPACA6 (Fig. S10a), especialmente del ectodominio con un RMSD de 1,1 Å en comparación con nuestra estructura resuelta (Fig. S10b), podemos confiar en que los aciertos identificados en SPACA6 probablemente sean precisos.Anteriormente, PSI-BLAST busca IZUMO1 agrupado con otras tres proteínas asociadas a espermatozoides: IZUMO2, IZUMO3 e IZUMO450.AlphaFold predice que estas proteínas de la familia IZUMO se pliegan en dominios 4HB con los mismos patrones de disulfuro que IZUMO1 (Figs. 3a y S11), aunque carecen del dominio similar a Ig.Se prevé que IZUMO2 e IZUMO3 sean proteínas de membrana de un solo paso como IZUMO1, mientras que IZUMO4 parece secretarse.No se han establecido las funciones de las proteínas IZUMO 2, 3 y 4 en la fusión de gametos.Se sabe que IZUMO3 desempeña un papel en la biogénesis del acrosoma durante el desarrollo del esperma51 y se ha observado que las proteínas IZUMO forman complejos50.La conservación de las proteínas IZUMO en mamíferos, reptiles y anfibios señala una función potencial alineada con las de otras proteínas conocidas asociadas a la fusión de gametos como DCST1/2, SOF1 y FIMP.un esquema de arquitectura de dominio de la superfamilia IST con los dominios 4HB, bisagra e Ig de color naranja, verde y azul, respectivamente.IZUMO4 tiene una región C-terminal única, que es de color negro.Los enlaces disulfuro supuestos y confirmados se muestran en líneas magenta sólidas y discontinuas, respectivamente.b Diagramas de cinta de la superfamilia IST de proteínas asociadas a la fusión de gametos IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB : AF-Q1ZYL8-F1) y TMEM95 (AlphaFold DB: AF-Q3KNT9-F1) que se muestran en el mismo esquema de color que en el panel A. Los enlaces disulfuro se muestran en magenta.No se muestran las hélices transmembrana de TMEM95, IZUMO2 e IZUMO3.A diferencia de las proteínas IZUMO, se prevé que las otras proteínas SPACA (es decir, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 y SPACA9) sean estructuralmente divergentes de SPACA6 (Fig. S12).Solo SPACA9 tiene un 4HB, pero no se prevé que tenga la misma orientación paralela-antiparalela que SPACA6 o los mismos enlaces disulfuro.Solo SPACA1 tiene un dominio similar a Ig.AlphaFold predice que SPACA3, SPACA4 y SPACA5 tienen estructuras completamente diferentes de SPACA6.Curiosamente, también se sabe que SPACA4 desempeña un papel en la fertilización, pero más arriba que SPACA6, y en cambio ayuda en las interacciones entre el esperma y la zona pelúcida del ovocito52.Nuestras búsquedas AlphaFold encontraron otra coincidencia con IZUMO1 y SPACA6 4HB, a saber, TMEM95.TMEM95 es una proteína transmembrana de un solo paso específica para espermatozoides que, cuando se extirpa, deja infértiles a los ratones macho32,33.Los espermatozoides que carecen de TMEM95 tienen morfología, motilidad y capacidad normales para penetrar la zona pelúcida y unirse al oolema, pero no pueden fusionarse con las membranas de los ovocitos.Estudios previos predijeron que TMEM95 tendría un parecido estructural con IZUMO133.De hecho, el modelo AlphaFold confirma que TMEM95 es un 4HB con el mismo par de motivos CXXC que IZUMO1 y SPACA6, así como el mismo disulfuro adicional entre las hélices 1 y 2 que se encuentran en SPACA6 (Figs. 3a y S11).Mientras que TMEM95 carece de un dominio similar a Ig, tiene una región con patrones de enlaces disulfuro similares a las regiones bisagra de SPACA6 e IZUMO1 (Fig. 3b).Durante la publicación de este manuscrito, la estructura de TMEM95 se informó en un servidor de preimpresión, lo que confirma los resultados de AlphaFold53. TMEM95, al igual que SPACA6 e IZUMO1, se conserva evolutivamente desde los anfibios (Figs. 4 y S13).Se usaron búsquedas PSI-BLAST usando SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP y SOF1 de la base de datos NCBI para determinar en qué parte del árbol de la vida se encuentran estas secuencias.Las distancias entre los puntos de bifurcación no están dibujadas a escala.Las sorprendentes similitudes estructurales generales entre SPACA6 e IZUMO1 sugieren que estos son los miembros fundadores de una superfamilia estructural conservada que incluye las proteínas 2, 3 y 4 de TMEM95 e IZUMO. Proponemos el nombre de superfamilia IST por las iniciales de los tres miembros que se sabe que son asociado con la fusión de gametos hasta ahora: IZUMO1, SPACA6 y TMEM95.Como solo ciertos miembros poseen un dominio similar a Ig, la característica distintiva de la superfamilia IST es el dominio 4HB, que tiene características únicas compartidas por todas estas proteínas: 1) el 4HB distorsionado tiene hélices empaquetadas en forma alternada antiparalela/paralela (Fig. 5a), 2) el paquete tiene una cara triangular formada por dos hélices dentro del paquete y una tercera hélice perpendicular (Fig. 5b), y 3) un motivo CXXC doble conecta la hélice perpendicular en el 4HB a una bisagra flexible región a través de enlaces disulfuro duales (Fig. 5c).Se sabe que el motivo CXXC, que se encuentra en las proteínas similares a la tiorredoxina, actúa como sensores redox54,55,56, y los motivos en los miembros de la familia IST podrían estar relacionados con el papel que juegan las proteínas disulfuro isomerasas como ERp57 en la fusión de gametos57,58.Los miembros de la superfamilia IST se definen por tres características distintivas del dominio 4HB: cuatro hélices que alternan entre orientaciones paralelas y antiparalelas, una cara triangular del haz helicoidal y un motivo doble CXXC que forma dos disulfuros (magenta) entre un pequeño Hélice N-terminal (naranja) y una horquilla β (verde) en la región bisagra.Dadas las similitudes entre SPACA6 e IZUMO1, se probó la capacidad del primero para unirse a IZUMO1 o JUNO.La interferometría de biocapas (BLI) es una técnica de unión basada en la cinética que se utilizó anteriormente para cuantificar la interacción entre IZUMO1 y JUNO.Tras la incubación de un IZUMO1 marcado con biotina y unido al sensor como cebo con altas concentraciones del analito JUNO, se detectó una fuerte señal (Fig. S14a), lo que indica un cambio inducido por la unión en el grosor del biomaterial adherido a la punta del sensor. .Se detectó una señal similar con el experimento inverso (es decir, JUNO unido al sensor como cebo contra el analito IZUMO1) (Fig. S14b).No se detectó ninguna señal cuando se usó SPACA6 como analito contra IZUMO1 unido al sensor o JUNO unido al sensor (Fig. S14a, b).Esta falta de señal proporciona evidencia de que el ectodominio SPACA6 no interactúa con los ectodominios de IZUMO1 o JUNO.Dado que el BLI como ensayo se basa en la biotinilación de residuos de lisina libres en la proteína del cebo, esta modificación puede evitar la unión si los residuos de lisina están involucrados en la interacción.Además, la orientación de unión relativa al sensor puede crear obstáculos estéricos;por lo tanto, también se realizaron ensayos pull-down tradicionales con ectodominios SPACA6, IZUMO1 y JUNO recombinantes.Independientemente, SPACA6 no se precipitó con IZUMO1 etiquetado con His o JUNO etiquetado con His (Fig. S14c, d), lo que indica un acuerdo con la falta de interacción observada en los experimentos BLI.Como control positivo, confirmamos la interacción de JUNO con IZUMO1 marcado con His (Figs. S14e y S15).A pesar de las similitudes estructurales entre SPACA6 e IZUMO1, la incapacidad de SPACA6 para unirse a JUNO no es del todo sorprendente.Hay más de 20 residuos en la superficie de IZUMO1 humano que interactúan con JUNO, incluidos residuos de cada una de las tres regiones (aunque la mayoría se encuentra en la región bisagra) (Fig. S14f).De estos residuos, solo uno se conserva en SPACA6 (Glu70).Si bien muchas sustituciones de residuos mantienen los atributos bioquímicos originales, el residuo Arg160 esencial en IZUMO1 se cambia a un Asp148 cargado negativamente en SPACA6;estudios previos mostraron que una mutación Arg160Glu en IZUMO1 abolió casi por completo la unión a JUNO43.Además, las diferencias en la orientación del dominio entre IZUMO1 y SPACA6 aumentan drásticamente la superficie del sitio de unión a JUNO de la región equivalente en SPACA6 (Fig. S14g).A pesar de la conocida necesidad de SPACA6 para la fusión de gametos y su similitud con IZUMO1, SPACA6 no parece realizar la función equivalente de unir JUNO.Por lo tanto, buscamos combinar nuestros datos estructurales con evidencia de importancia proporcionada por la biología evolutiva.Las alineaciones de secuencias de los homólogos de SPACA6 sugieren una conservación de la estructura general más allá de los mamíferos.Por ejemplo, los residuos de cisteína están presentes incluso en animales anfibios lejanamente relacionados (Fig. 6a).Usando el servidor ConSurf, los datos de conservación de una alineación de secuencias múltiples de 66 secuencias se mapearon en la superficie de SPACA6.Este tipo de análisis puede revelar aquellos residuos que se han mantenido a lo largo de la evolución de la proteína y puede sugerir qué áreas de superficie juegan un papel en la función.a Alineación de secuencias de ectodominios SPACA6 de doce especies diferentes preparadas con CLUSTAL OMEGA.La mayoría de las posiciones conservadas según el análisis ConSurf están coloreadas en azul.Los residuos de cisteína están resaltados en rojo.Los límites de dominio y los elementos de la estructura secundaria se muestran en la parte superior de la alineación con flechas que indican cadenas beta y una onda que indica hélices.Los ID de acceso de NCBI para las secuencias incluidas son los siguientes: humano (Homo sapiens, NP_001303901), mandril (Mandrillus leucophaeus, XP_011821277), capuchino (Cebus imitator, XP_017359366), caballo (Equus caballus, XP_023506102), orca (Orcinus orca, XP_012394831), oveja (Ovis aries, XP_014955560), elefante (Loxodonta africana, XP_010585293), perro (Canis lupus familiaris, XP_025277208), ratón (Mus musculus, NP_001156381), demonio de Tasmania (Sarcophilus harrisii, XP_031819146), ornitorrinco (Ornithorhynchus anatinus,768_0838), XP_0838 y rana toro (Bufo bufo, XP_040282113).La numeración se basa en la secuencia humana.b Representación superficial de la estructura SPACA6 orientada con 4HB en la parte superior y el dominio similar a Ig en la parte inferior y coloreada según los puntajes de conservación del servidor ConSurf.Las porciones más conservadas son de color azul, las porciones con niveles intermedios de conservación son blancas y las porciones menos conservadas son amarillas.Las cisteínas son de color magenta.Tres parches de superficie que muestran altos niveles de conservación se muestran en los recuadros etiquetados Parches 1, 2 y 3. Se muestra una representación de dibujos animados del 4HB en el recuadro superior derecho (mismo esquema de color).La estructura SPACA6 tiene tres parches de superficie altamente conservados (Fig. 6b).El parche 1 abarca el 4HB y la región bisagra, y contiene los dos puentes disulfuro CXXC conservados, la red bisagra Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 (Fig. S7), así como tres residuos aromáticos conservados que miran hacia afuera (Phe31, Tyr73, Phe137 ).El parche 2 abarca el borde más ancho del dominio similar a Ig (Fig. S6e), que presenta varios residuos cargados positivamente hacia la superficie del esperma.Curiosamente, este parche contiene un epítopo de anticuerpo que anteriormente se demostró que evitaba el funcionamiento de SPACA630.El parche 3 abarca la bisagra y un lado del dominio similar a Ig;esta región tiene prolinas conservadas (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) y residuos polares/cargados orientados hacia el exterior.Extrañamente, la mayoría de los residuos en la superficie de 4HB son bastante variables (Fig. 6b), a pesar de la conservación del pliegue en los homólogos de SPACA6 (como lo indica la conservación del núcleo hidrofóbico del paquete) y más allá en la superfamilia IST.Aunque es la región más pequeña de SPACA6 con la menor cantidad de elementos de estructura secundaria definibles, muchos residuos de la región bisagra (incluido el parche 3) están altamente conservados entre los homólogos de SPACA6, lo que quizás indica que la orientación del haz helicoidal y el sándwich β tienen un propósito conservado.Sin embargo, a pesar de las extensas redes electrostáticas y de enlaces de hidrógeno dentro de las regiones bisagra de SPACA6 e IZUMO1, se puede ver evidencia de flexibilidad inherente en una alineación de las múltiples estructuras IZUMO1 resueltas37,43,44.Las alineaciones de los dominios individuales se superponen bien, pero la orientación de los dominios entre sí varía entre 50° y 70° desde el eje central (Fig. S16).Para comprender la dinámica conformacional de SPACA6 en solución, se realizaron experimentos SAXS (Fig. S17a, b).Las reconstrucciones ab initio del ectodominio SPACA6 fueron consistentes con la estructura cristalina en forma de barra (Fig. S18), aunque la gráfica de Kratky revela un nivel de flexibilidad (Fig. S17b).Esta conformación contrasta con IZUMO1 donde la proteína libre adopta una forma de boomerang en la red cristalina y en solución43.J. Clin.Invertir.Frente.Biol.Biol.Biol.reprod.Annu Rev. Cell Dev.Biol.Nat.Estructura.mol.Biol.Annu Rev. Cell Dev.Biol.Annu Rev.Virol.Nat.Biol celular.von Besser, K., Frank, AC, Johnson, MA y Preuss, D. Arabidopsis HAP2 (GCS1) es un gen específico del esperma necesario para la guía y la fertilización del tubo polínico.Desarrollo 133, 4761–4769 (2006).Liu, Y. et al.Genes Dev.J. Cell Biol.Nat.Gineta.desarrolloBiol.Tararear.reprod.cienciacomúnBiol.mamágenomaactualBiol.cristalogr.Biomol.Estructura.Annu Rev. Immunol.J. Mol.Biol.Biol.Nat.Rev Mol.Biol celular.NúcleoÁcidos Res.mol.reprod.desarrollomol.reprod.desarrolloJ. Biol.químicaprog.Biografía.mol.Biol.desarrolloCélula.Nat.comúnBiol.PLOS Biol.actualBiol.Reproducción.NúcleoÁcidos Res.Biol.cristalogr.Acta Cryst.Nat.Acta Cryst.Acta Cryst.Acta Cryst.Biol.cristalogr.cristalogr.Ciencia de las proteínasCiencia de las proteínasJ. Radiación de Sincrotrón.J. Radiación de Sincrotrón.J. Radiación de Sincrotrón.Biografía.ICREA, pág.También puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarTambién puede buscar este autor en PubMed Google ScholarLos autores declaran no tener conflictos de intereses.Los informes de los revisores están disponibles.Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios.Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material.Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor.Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedItAl enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad.Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.Regístrese para recibir el boletín informativo Nature Briefing: lo que importa en ciencia, gratis en su bandeja de entrada todos los días.